На примере L-фенилаланинсекретирующего штамма грамотрицательных факультативных метилотрофных бактерий Brevibacterium methylicum продолжены биотехнологические исследования по использованию метилотрофных бактерий для препаративного микробного синтеза аминокислот, меченных стабильными изотопами, в том числе дейтерием (2Н). Представлены данные по адаптации штамма В. methylicum к максимальной концентрации дейтерия в среде: 98% 2Н2O и 2% [2Н]метанол и биосинтезу дейтерий-меченного L-фенилаланина. Штамм адаптирован к 2Н2О посредством рассева клеток на твердые (2% агар) минимальные среды с увеличивающимся градиентом концентрации 2Н2O: от 0; 24,5; 49,0; 73,5 до 98% 2Н2О и последующей селекции отдельных устойчивых к 2Н2О колоний клеток, способных продуцировать L-фенилаланин. Разработанный метод микробного синтеза позволяет получать дейтерий-меченный L-фенилаланин (выход 0,8 г/л) разной степени изотопного обогащения в зависимости от концентрации 2Н2O в ростовой среде: от 17% (на среде с 24,5% 2Н2О) до 75% (на среде с 98% 2Н2О) дейтерия в молекуле, что подтверждено данными масс-спектрометрического анализа электронного удара (ЭУ) метиловых эфиров N-(диметиламино)нафтален-1-сульфонил хлоридных (дансильных) производных фенилаланина, выделенных из культуральной жидкости штамма-продуцента.

Список ссылок

1. LeMaster D.M. Uniform and selective deuteration in two-dimensional NMR studies of proteins / Annu. Rev. Biophys. Chem. 1990. V. 19. P. 243-266
2. Vertes A. / In. Physiological effect of heavy water // Elements and isotopes: formation, transformation, distribution. - Dordrecht: Kluwer Acad. Publ. 2003. P. 111–112.
3. Crespi H. L. Biosynthesis and uses of per-deuterated proteins / In: Synthesis and Applications of Isotopically labeled Compounds. Proceedings of the Second Inter. Symp. Elsevier. 1986. P. 111-112.
4. MacCarthy P. Infrared spectroscopy of deuterated compounds: an undergraduate experiment. / J. Chem. Educ. 1985. V. 62 (7). P. 633.
5. Мосин О.В., Складнев Д.А., Егорова Т.А., Швец В.И. Масс-спектрометрическая оценка уровня включения 2Н и 13С в молекулы аминокислот бактериальных объектов / Биоорганическая химия. 1996. Т. 22. № 10-11. С. 856-869.
6. Kushner D.J., Baker A., Dunstall T.G. Pharmacological uses and perspectives of heavy water and deuterated compounds / Can. J. Physiol. Pharmacol. 1999. V. 77 (2). P. 79–88.
7. Складнев Д.А., Мосин О.В., Егорова Т.А., Еремин С.В., Швец В.И. Метилотрофные бактерии – источники изотопномеченых 2Н- и 13С-аминокислот / Биотехнология. 1996. № 5. С. 25-34.
8. Мосин О.В. Исследование методов биотехнологического получения аминокислот, белков и нуклеозидом, меченных стабильными изотопами 2Н и 13С с высокими уровнями изотопного обогащения. Автореф. диссерт. к.х.н. МГАТХТ им. М. В. Ломоносова. 1996. с. 1-26.
9. Dewick P.M. / In. Medicinal Natural Products: A Biosynthetic Approach. 3. Auflage, John Wiley & Sons Ltd. - 2009. S. 137–186
10. Karnaukhova E.N., Mosin O.V., Reshetova O.S. Biosynthetic production of stable isotope labeled amino acids using methylotroph Methylobacillus flagellatum / Amino Acids. 1993. V. 5. № 1. P. 125.
11. Мосин О.В., Складнев Д.А., Егорова Т.А., Юркевич А.М., Швец В.И. Изучение биосинтеза аминокислот штаммом Brevibacterium methylicum при росте на средах, содержащих тяжелую воду и дейтерометанол / Биотехнология. 1996. № 3. С. 3-12.
12. Мосин О.В., Карнаухова Е.Н., Пшеничникова А.Б., Складнев Д.А., Акимова О.Л. Биосинтетическое получение дейтериймеченого фенилаланина, секретируемого метилотрофным мутантом Brevibacterium methylicum / Биотехнология. 1993. № 9. С. 16-20.
13. Boer L de, Harder W, Dijkhuizen L. Phenylalanine and Tyrosine Metabolism in the Facultative Methylotroph Nocardia sp. 239. / Arch Microbiol. 1988. V. 149. P. 459-465.
14. Roberts C.W. The shikimate pathway and its branches in apicomplexan parasites // J. Infect. Dis. 2002. V. 185 (1). P 25–36.
15. Бохински Р. / В кн.Современные воззрения в биохимии. - Москва. Мир. 1987. с. 443-444.
16. Rouse, B., Azen, B., Koch, R., Matalon, R., Hanley, W., de la Cruz, F., Trefz, F., Friedman, E., Shifrin, H. Maternal phenylketonuria collaborative study (MPKUCS) offspring: Facial anomalies, malformations, and early neurological sequelae / American Journal of Medical Genetics. 1997. V. 69(1). P. 89–95
17. Mosin O.V., Skladnev D.A., Shvets V.I. Biosynthesis of 2H-labeled phenylalanine by a new methylotrophic mutant Brevibacterium methylicum / Bioscience, biotechnology, and biochemistry. V. 62. № 2. P. 225-229.
18. Мосин О.В., Складнев Д.А., Швец В.И. Изучение физиологической адаптации бактерий к тяжёлой воде / Биотехнология. 2000. № 10. С. 16-23.
19. Троценко Ю.А. Биохимия и физиология метилотрофных микроорганизмов / Сб. научн. стат. АН СССР. Институт биохимии и физиологии микроорганизмов. - Пущино. 1987. с. 15.

Brevibacterium methylicum, L-фенилаланин, биосинтез, тяжелая вода, масс-спектрометрия ЭУ