Открытый доступ  Доступ платный или только для подписчиков

Статья подготовлена по материалам публикаций специалистов Sartorius в зарубежном издании BioProcess International, а также на основании опыта практического применения описанной технологии и продуктов в лабораторном и производственном масштабах.

На сегодняшний день одноразовые технологии широко используются в биофармацевтическом производстве. Однако, несмотря на бурное развитие и очевидные преимущества одноразовых технологий [1-3], в некоторых случаях они все еще не могут конкурировать с классическими методами производства. Так, например, когда речь идет о высокой плотности клеток, высоких титрах и мутности, а также высокой концентрации примесей на таких стадиях как сбор клеток, использование одноразовых технологий может иметь ограничения [4-6].

Ситуация осложняется и тем, что за последние годы в биофармацевтической промышленности были достигнуты значительные успехи в области увеличения получаемых концентраций целевого продукта. Так, например, производители моноклональных антител смогли добиться получения титров продукта в диапазоне 5 – 10 г/л при использовании стандартных культур клеток млекопитающих [7, 8]. Увеличение выхода продукта позволило использовать емкости меньшего объема, благодаря этому 2000-литровые одноразовые биореакторы сегодня представляют собой достаточно эффективное решение со стороны экономики и технологии производства.

Следует отметить, что высокие титры продукта чаще являются результатом увеличения плотности клеток, а не роста их продуктивности. Увеличение концентрации используемой биомассы, закономерно приводит к увеличению концентрации клеточного детрита и таких загрязняющих агентов как белки клеток-хозяев и ДНК, содержащихся в культуральной жидкости. В результате этого возрастает нагрузка на оборудование, используемое на стадии сбора клеток и очистки культуральной жидкости.

В случае использования многоразового оборудования процесс очистки может состоять из нескольких стадий: центрифугирование с целью удаления клеток и частиц размером более 1 мкм, глубинная фильтрация с целью удаления более мелких частиц и финальная фильтрация. Основным трендом в биофармацевтической отрасли сегодня является переход на полностью одноразовые линии производства. Включение же в одноразовую линию стадий, на которых подразумевается использование многоразового оборудования, полностью нивелирует преимущества одноразовых технологий.

Вместе с тем, как уже упоминалось выше, использование одноразового оборудования в случае более высоких концентраций биомассы не всегда возможно из-за технических ограничений. Так, например, одноразовые центрифуги, появившиеся на рынке относительно недавно, несмотря на высокую стоимость, имеют достаточно низкую емкость и производительность. Кроме того, процесс центрифугирования в одноразовом исполнении с трудом поддается масштабированию.

Поэтому на сегодняшний день наиболее распространенным методом сбора клеток является глубинная фильтрация с использованием одноразовых фильтрующих модулей. Данный метод убедительно доказал свою эффективность, однако он также имеет ряд недостатков. Так, например, фильтрующие модули требуют предварительной промывки, что удорожает процесс фильтрации и увеличивает его трудоемкость. Кроме того, при фильтрации объемов до 2000 л, что является на сегодняшний день верхним пределом емкости одноразовых биореакторов, использование фильтрующих модулей часто не целесообразно по причине относительно высокой стоимости при низкой емкости. Следует подчеркнуть, что эффективность фильтрующих модулей сильно зависит от жизнеспособности клеток, а этот показатель, как известно, может сильно варьироваться от партии к партии. Поэтому расчет необходимых площадей фильтрации осуществляется с большим запасом, чтобы фильтрующие модули смогли справиться с поставленной задачей даже при экстремальных значениях жизнеспособности клеток. Это, в свою очередь также сказывается на стоимости расходных материалов.

Таким образом, несмотря на то, что за последние годы был достигнут значительный прорыв в области одноразовых технологии, отдельные стадии такие, как сбор клеток, все еще требуют доработки для увеличения надежности и снижения стоимости. При этом поиск технологических решений данной проблемы осуществляется в нескольких направлениях: осаждение [5], тангенциальная фильтрация [9], коагуляция [10], динамическая объемная фильтрация [11]. Более того, рядом исследователей были предприняты попытки полного ухода от стадии очистки и осуществления прямого сбора целевого продукта на адсорбенте [12].

Одним из наиболее перспективных методов решения данной задачи на сегодняшний день является динамическая объемная фильтрация с использованием диатомовой земли. Этот метод в течение многих лет успешно используется при фракционировании плазмы крови, которая характеризуется сложным составом и высокими концентрациями различных компонентов. В данном случае фракционирование основано на принципах селективного осаждения с помощью изменения значения рH, ионной силы, добавления спирта и изменения температуры. Образующийся осадок удаляется с помощью глубинной фильтрации. При этом в процессе фильтрации используется диатомовая земля в форме порошка, который добавляется для увеличения пропускной способности фильтра.

Основное отличие описываемой технологии от классической глубинной фильтрации заключается в следующем: при фильтрации растворов с высокой концентрацией и сложным составом частиц, формирующаяся на фильтрующей поверхности фильтрационная корка быстро становится непроницаемой и блокирует поток жидкости (рис 1а). Однако добавление высокопористой порошкообразной диатомовой земли приводит к образованию фильтрационной корки, обладающей более высокой степенью проницаемости, что предотвращает блокирование фильтра (рис.1б). При этом минимальное количество диатомовой земли, гарантирующее беспрепятственную фильтрацию, зависит от концентрации частиц в растворе.

Рис.1. Сравнение классической глубинной фильтрации (а) и динамической фильтрации (б)

Первое применение диатомовой земли в качестве фильтра при фракционировании человеческой плазмы было описано более 50 лет назад [13]. С тех пор данная технология широко используется в процессах производства внутривенных иммуноглобулинов, альбумина и факторов свертывания крови [14-16]. Однако возможность использования данной технологии в одноразовом исполнении в качестве альтернативы центрифугам и глубинным фильтрам в процессе сбора клеток требует решения ряда задач.

Это связано как с необходимостью подбора диатомовой земли и оптимальных условий процесса, так и поиском технического решения и интегрированием данного решения в концепцию полностью одноразовой линии производства. Техническое решение, поддерживающее реализацию концепции производственной системы на базе одноразовой технологии, заключается в разработке одноразовых фильтрующих модулей и, отвечающего всем техническим регламентам, способа внесения порошкообразной диатомовой земли в условиях классифицированных помещений.

Рис. 2. Аппаратное наполнение Sartoclear Dynamics® для промышленного производства.

Все эти задачи были реализованы в ходе разработки продукта Sartoclear Dynamics® производства компании Sartorius Stedim Biotech. Культуральная жидкость переносится из одноразового биореактора в мешок для перемешивания MagMix®. В этот же мешок с помощью системы беспылевой подачи порошка осуществляется внесение диатомовой земли. После этого при постоянном перемешивании смесь культуральной жидкости и диатомовой земли перистальтическим насосом подается на одноразовые фильтрующие модули. На выходе из этих модулей собирается фильтрат, который поступает на следующие стадии (Рис. 2).

В ходе разработки Sartoclear Dynamics® проводились как лабораторные исследования, так и фильтрация на пилотной установке. В ходе лабораторных исследований было рассмотрено несколько видов диатомовой земли с разным размером частиц, проницаемостью и концентрацией. Кроме того, работы проводились с использованием различных клеточных линий и культуральных сред. Рассматривались различные начальные условия (концентрация клеток и жизнеспособность), а также влияние значения рН на эффективность процесса фильтрации.

Так, в результате тестирования четырех видов диатомовой земли Celpure было установлено, что диатомовая земля Celpure C100 с проницаемостью 70-140 мД показала самую высокую емкость (374 л/м2), а мутность фильтрата составила 55 ЕНМ (рис. 3а). Для диатомовой земли с более низкой проницаемостью (Celpure C60, 40-80 мД) при низких показателях мутности (49 ЕНМ) была получена достаточно низкая емкость (292 л/м2). Диатомовая земля Celpure C1000 (750 – 1250 мД) показала самую низкую емкость (288 л/м2) и самую высокую мутность фильтрата (69 ЕНМ). Наиболее приемлемые результаты были получены для диатомовой земли Celpure C300 (150 – 300 мД): при емкости 366 л/м2 мутность раствора составила 51 ЕНМ.

Кроме того было установлено, что несмотря на то, что емкость системы и качество фильтрата во многом зависят от типа диатомовой земли, количество диатомита, вносимого в культуральную жидкость, также играет важную роль. Наиболее оптимальным соотношением диатомовой земли Celpure C300 к общей биомассе оказалось 0,51 г/г. При этом емкость системы составила 366 л/м2, а мутность фильтрата – 51 ЕНМ (рис. 3б). При этом следует отметить, что недостаточное количество диатомовой земли в растворе приводит к формированию фильтрационной корки с недостаточной проницаемостью, а избыток диатомита приводит к преждевременному заполнению фильтрационного модуля и ограничению емкости системы. Таким образом, основной задачей пробной фильтрации является определение оптимальной концентрации диатомита. В ходе дальнейших исследований было установлено, что оптимальным соотношением диатомита и общей биомассы при рН 7 является 0,44.

В ходе лабораторных работ также проводилось исследование влияния изменения значения рН на эффективность процесса фильтрации (Рис. 3в). Было установлено, что емкость фильтрующей системы при рН 5 в 7 раз выше, чем при рН 7. А мутность фильтрата при понижении рН снижется примерно в 5 раз. Таким образом, понижение рН позволяет уменьшить концентрацию диатомита на 50% при сохранении достаточно высокой емкости системы и качества фильтрата.

Рис. 3 Результаты пробной фильтрации: а) сравнение типов диатомовой земли; б) соотношение диатомовая земля / общая биомасса (г/г); в) изменение значения рН

Для определения возможности масштабирования данного процесса совместно с компанией Rentschler Biotechnologie была проведена пробная фильтрация растворов большого объема на пилотной установке. На базе производственных мощностей компании Rentschler Biotechnologie были проведены эксперименты по возможности использования данного метода в промышленном производстве. Культуральная жидкость СНО объемом 600л, плотностью 17,6х106 клеток/мл и жизнеспособностью клеток 95% была профильтрована за 1 час. Для фильтрации использовались одноразовые модули Sartorius Stedim Biotech для динамической фильтрации (рис. 4). В общей сложности в 600-литровый объем культуральной жидкости было внесено 12 кг диатомовой земли Cellpure® С300 (производства компании Advanced Minerals). В ходе процесса фильтрации наблюдалась высокая, стабильная скорость потока. Показатель скорости составил чуть более 300 л/м2/ч. Фильтрат характеризовался очень низкой мутностью (5-8 ЕНМ). Выход целевого продукта составил более 85%.

Рис. 4. (а) держатель модулей для динамической фильтрации; (б) одноразовый модуль для динамической фильтрации; (в) направление потока внутри модуля: культуральная жидкость (красная линия), фильтрат (зеленая линия), полиэтиленовая мембрана (пунктирная линия).

В ходе лабораторных экспериментов по масштабированию процесса использовалась диатомовая земля Celpure C300. Была выполнена фильтрация в различных режимах: с использованием глубинного фильтра, одного модуля для динамической фильтрации (площадь фильтрации 0,23 м²), в т. ч. в режиме с понижением pH и на следующем шаге, фильтрация проводилась с семью одноразовыми модулями с аналогичной площадью фильтрации. Результаты эксперимента по масштабированию с различными линиями клеток млекопитающих, и культуральными средами показали наличие устойчивой связи между общей биомассой и требуемым количеством диатомовой земли при постоянном значении рН. Для всех протестированных культур оптимальная концентрация диатомовой земли находилась в диапазоне 40-50% от общей биомассы. Во всех случаях это соотношение могло быть уменьшено до величины 20-30% при понижении рН.

Различия при фильтрации подкисленных (рН 4,3-5,5) и нейтральных культуральных жидкостей объясняются дополнительным осаждением более мелких частиц в результате понижения рН. Кроме того, понижение рН приводило к уменьшению содержания в растворе таких примесей, как ДНК и белки клеток-хозяев. При этом понижение рН не приводило к снижению выхода целевого продукта, т.к. большинство моноклональных антител устойчивы к понижению рН в выбранном диапазоне.

Выводы.

Sartoclear Dynamics® является современным масштабируемым одноразовым методом сбора клеток, позволяющим проводить эффективную очистку культуральных жидкостей с высокой плотностью клеток.

Данный метод характеризуется высокой скоростью потока и не зависит от жизнеспособности клеток.

Кроме удаления клеток данный метод позволяет значительно снижать концентрацию таких примесей как белки клеток-хозяев и ДНК.

Процесс очистки не требует предварительной промывки и осуществляется в одну стадию, что обеспечивает экономию производственных площадей и снижает затраты.

Список ссылок.

1 Eibl R, Eibl D. Application of Disposable Bag-bioreactors in Tissue Engineering and for the Production of Therapeutic Agents. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 2009: 183–207.

2 Shukla AA, Gottschalk U. Single-Use Disposable Technologies for Biopharmaceutical Manufacturing. Trends Biotechnol. 31, 2013: 147–154.

3 Zheng R. The Game Changer. BioProcess Int. 8(4) 2010: S4–S9.

4 Lee B, Langer E, Zheng R. Next Generation Single-Use Bioreactor Technology and the Future of Biomanufacturing: A Summary from the Manufacturers and Users Perspective. Single-Use Technology in Biopharmaceutical Manufacture. Eibl R, Eibl D, Eds. Wiley-VCH Verlag GmbH: Weinheim, Germany, 2011: 183–194.

5 Minow B, Rogge P, Thompson K. Implementing a Fully Disposable MAb Manufacturing Facility. BioProcess Int. 10(6) 2012: 48–57.

6 Wagner R, Mueller D. Full Plastics: Consequent Evolution in Pharmaceutical Biomanufacturing from Vial to Warehouse. Biopharmaceutical Production Technology. Subramanian G, Ed. Wiley-VCH: Germany, 2012: 745–767.

7 Kelley B. Industrialization of MAb Production Technology: The Bioprocessing Industry at a Crossroads. MAbs 1(5) 2009:443–452.

8 Buttler M. Animal Cell Cultures: Recent Achievements and Perspectives in the Production of Biopharmaceuticals. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2005, 283–291.

9 Reis van R, et al. Industrial Scale Harvest of Proteins from Mammalian Cell Culture By Tangential Flow Filtration. Biotechnol Bioeng. 38, 1991: 413–422.

10 Riske F, et al. The Use of Chitosan As a Flocculant in Mammalian Cell Culture Dramatically Improves Clarification Throughput Without Adversely Impacting Monoclonal Antibody Recovery. J. Biotechnol. 128, 2007: 813–823.

11 Delavaille D. How to Apply Old Techniques to New Processes. European Downstream Technology Forum, 7–8 September 2010, Goettingen, Germany. Sartorius Stedim Biotech AG: Goettingen, Germany.

12 Anton F, et al. Application of Direct Capturing in Downstream Processing of Proteins Using Membrane Based Chromatography (poster). BioPerspektives 31 May – 1 June 2007, Cologne, Germany.

13 Cohn EJ, et al. Preparation and Properties of Serum and Plasmaproteins, IV: A System for Separation into Fractions of the Protein and Lipoprotein Components of Biological Tissue and Fluids. J. Am. Chem. Soc. 68, 1946: 459–475.

14 Curling J, et al. Production of Plasma Proteins for Therapeutic Use. Wiley-Blackwell: Hoboken, NJ, 2012.

15 More J, et al. Purification of Albumin from Plasma. Blood Separation and Plasma Fractionation. Harris J, Ed. Wiley-Liss: Hoboken, NJ, 1991.

16 Stucki M, and al. Investigations of Prion and Virus Safety of a New Liquid IVIG Product. Biologicals 36, 2008: 239–247.

Sartoclear Dynamics, культуральная жидкость, биореактор, эукариотический продуцент, одноразовые технологии

Eibl R, Eibl D. Application of Disposable Bag-bioreactors in Tissue Engineering and for the Production of Therapeutic Agents. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 2009: 183–207.

Shukla AA, Gottschalk U. Single-Use Disposable Technologies for Biopharmaceutical Manufacturing. Trends Biotechnol. 31, 2013: 147–154.

Zheng R. The Game Changer. BioProcess Int. 8(4) 2010: S4–S9.

Lee B, Langer E, Zheng R. Next Generation Single-Use Bioreactor Technology and the Future of Biomanufacturing: A Summary from the Manufacturers and Users Perspective. Single-Use Technology in Biopharmaceutical Manufacture. Eibl R, Eibl D, Eds. Wiley-VCH Verlag GmbH: Weinheim, Germany, 2011: 183–194.

Minow B, Rogge P, Thompson K. Implementing a Fully Disposable MAb Manufacturing Facility. BioProcess Int. 10(6) 2012: 48–57.

Wagner R, Mueller D. Full Plastics: Consequent Evolution in Pharmaceutical Biomanufacturing from Vial to Warehouse. Biopharmaceutical Production Technology. Subramanian G, Ed. Wiley-VCH: Germany, 2012: 745–767.

Kelley B. Industrialization of MAb Production Technology: The Bioprocessing Industry at a Crossroads. MAbs 1(5) 2009:

–452.

Buttler M. Animal Cell Cultures: Recent Achievements and Perspectives in the Production of Biopharmaceuticals. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2005, 283–291.

Reis van R, et al. Industrial Scale Harvest of Proteins from Mammalian Cell Culture By Tangential Flow Filtration. Biotechnol Bioeng. 38, 1991: 413–422.

Riske F, et al. The Use of Chitosan As a Flocculant in Mammalian Cell Culture Dramatically Improves Clarification Throughput Without Adversely Impacting Monoclonal Antibody Recovery. J. Biotechnol. 128, 2007: 813–823.

Delavaille D. How to Apply Old Techniques to New Processes. European Downstream Technology Forum, 7–8 September 2010, Goettingen, Germany. Sartorius Stedim Biotech AG: Goettingen, Germany.

Anton F, et al. Application of Direct Capturing in Downstream Processing of Proteins Using Membrane Based Chromatography (poster). BioPerspektives 31 May – 1 June 2007, Cologne, Germany.

Cohn EJ, et al. Preparation and Properties of Serum and Plasmaproteins, IV: A System for Separation into Fractions of the Protein and Lipoprotein Components of Biological Tissue and Fluids. J. Am. Chem. Soc. 68, 1946: 459–475.

Curling J, et al. Production of Plasma Proteins for Therapeutic Use. Wiley-Blackwell: Hoboken, NJ, 2012.

More J, et al. Purification of Albumin from Plasma. Blood Separation and Plasma Fractionation. Harris J, Ed. Wiley-Liss: Hoboken, NJ, 1991.

Stucki M, and al. Investigations of Prion and Virus Safety of a New Liquid IVIG Product. Biologicals 36, 2008: 239–247.