Разработка эффективной хроматографической технологии очистки рекомбинантного N,N-бис-метионилгистона Н1.3 от бактериальных эндотоксинов.

N. S. Brykova, N. A. Bragina, D. A. Gusarov, D. I. Bairamashvili

Аннотация


Одним из важнейших показателей качества как конечного продукта, так и полупродуктов в технологическом процессе, особенно в производстве рекомбинантных белков, является содержание бактериальных эндотоксинов. Удаление их из фармакологических препаратов является необходимым шагом из-за их сильной биологической активности, вызывающей пирогенные и шоковые реакции у человека. Однако, из-за сильной стабильности БЭ и устойчивости к высоким температурам и величинам рН очистка белков от них затруднительна. Кроме того, очистка положительно заряженных белков, образующих устойчивые комплексы с липополисахаридами, еще более сложна. Примерами таких белков, имеющих сильный положительный заряд (pI больше 10,5), являются гистоны. Целью нашей работы было разработать эффективную технологию хроматографической очистки рекомбинантного N,N-бисметионилгистона Н1.3 от эндотоксинов. В качестве предварительной стадии очистки мы рассматривали катионообменную хроматографию, оптимизация которой позволила получить полупродукт, содержащий 40-80 ЕЭ/мг. Дальнейшую доочистку проводили с использованием ОФ ВЭЖХ. Нами было подтверждено, что при использовании ВЭЖХ содержание эндотоксинов не превышает 0,5 ЕЭ/мг. Однако со временем ВЭЖХ-сорбент накапливает липополисахариды, которые начинают десорбироваться во время процесса очистки, загрязняя целевой продукт. В связи с этим нами был разработан оптимальный протокол депирогенизации сорбента.


Список ссылок

1.    Cole R.D. / Int. J. Peptide Protein Res. 1987 V.30. P.433-449.
2.    Albig W., Runge D.M., Kratzmeier M., Doenecke D. / FEBS Lett. 1998. V.435. P.425-250.
3.    Thoma F., Koller T., Klug A. / J.Cell Biol. 1979. V.83. P.403-427.
4.    Maxson R., Cohn R., Kedes L., Mohun T. / Annu. Rev. Genet. 1983. V.17. P.239-277.
5.    Pohlmeier K., Behnke B., Wick R.Z.G., Mayer G. / Recombinant Production of Human Histone 1 Subtypes and Their Use for Therapeutic Purposes // United States Patent Application 20030078204.
6.    Anderson L., Unger F. / ACS Symposium Series, No.231, American Chemical Society, Washington, DC. 1983. P.1.
7.    Hou K.C., Zaniewski R. / Biotechnol. Appl. Biochem. 1990. V.12. P.315-321.
8.    Drugs and Pharmaceutical sciences, vol.167. Endotoxins: Pyrogens, LAL Testing and Depyrogenation, Third Edition, edited by Williams K.L., Marcel Dekker, Inc., IN, USA. 2007. 440 p.
9.    Drugs and Pharmaceutical sciences, vol.129. Pharmaceutical Process Validation, an international third edition, revised and expanded, edited by Nash R.A., Wachter A.H., Marcel Dekker, Inc., NY, USA. 2003. 536 p.
10.    Д.А.Гусаров / Биофармацевтический Журнал. 2009. Т.1. №3. С.10-17.
11.    Gross P., Jornvall H., Thiry M., Formicka-Zeppezauer G., Zeppezauer M. /Bis-Met Histone // World Intellectual Property Organization Patent Application, WO 2008 /122434 A1.2008
12.    URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/4885377?report=genpept
13.    King J., Laemmli U.K. / J.Mol.Biol. 1973. V.75 (2). P.315-324.
14.    Рябко Ю.С., Лукин О.В., Шепель Е.Н., Шибанова Е.Д., Баирамашвили Д.И. / Биофармацевтический Журнал. 2009.Т.1. №1. С.34-37.
15.    Д.А.Гусаров, В.А.Ласман, С.А.Косарев, И.В.Соколова, Т.В.Воробьева, Д.И.Баирамашвили, Д.Д.Генкин, Г.Формичка-Цеппезауер / Биофармацевтический Журнал. 2010. Т.2. №1. С.42-48.
16.    Shands J.W., Graham J.A., Nath K. / J. Mol. Biol. 1967. V.25. P.15-16.
17.    Hannekart-Pokorni E., Dekagel D., Depuydt F. / Eur. J. Biochem. 1973. V.38. P.6-13.
18.    Seydel U., Labischinski H., Kastowsky M. / Immunobiology. 1993. V.187. P.191-197.
19.    Pyo S.-H., Park H.-B., Hong S.-S., Kim J.-H. / Biotechnol. Lett. 2001. V.23. P.737-740.
20.    Yasaka Y., Tanaka M. / J. Chromatogr. B. 1994. V.659. P.139-143.
21.    Li Y., Lander R., Manger W., Lee A. / J. Chromatogr. B. 2004. V.804. P.353-358.
22.    HPLC of Biological Macromolecules. Methods and Applications, edited by Gooding K.M., Regnier F.E., Marcel Dekker, Inc., NY, USA. 1990. P.796.
23.    Kroeff E.P., Owens R.A., Campbell E.L., Johnson R.D., Marks H.I. / J. Chromatogr. 1989. V.461. P.45-61.
24.    Гусаров Д.А., Востриков В.В., Ручко Е.А., Ласман В.А., Михалев А.В., Баирамашвили Д.И. / Биотехнология. 2006. №2. С.44-49.
25.    Karlsson G., Gellerfors P., Persson A., Noren B., Edlund P.O., Sandberg C., BirnBaum S. / J. Chromatogr. A. 1999. V.855. P.147-155.
26.    Sainathan S.K., Tu L., Bishnupuri K.S., Han M., Li A., Newberry R.D., McDonald K.G., Crimmins D.L., Houchen C., Anant S., Dieckgraefe B.K. / Prot. Exp. Purif. 2005. V.44. 94-103.
27.    Hershenson S., Shaked Z. / Purification of recombinant beta-interferon incorporating RP-HPLC, United States Patent. 1990. No.4,894,330.

Ключевые слова


бактериальные эндотоксины, депирогенизация, хроматографическая очистка, N,N-бис-метионилгистон Н1.3

Полный текст: PDF (English) PDF

Ссылки

  • Ссылки не определены.


** ** ** ** ** **

ISSN: 2073-8099

** ** ** ** ** **

 

Подписаться на наши издания Вы можете через каталоги «Газеты. Журналы», сайт http://press.rosp.ru/ Агентства «Роспечать», а также в киосках «Роспечать» в Брянске, Владимире, Краснодаре, Рязани и Иркутске.