Содержание бактериальных эндотоксинов в белковых активных фармацевтических субстанциях (АФС) является одним из важнейших нормируемых показателей как при контроле качества готового продукта, так и внутрипроизводственного контроля. Эндотоксины – это липополисахариды (ЛПС) внешней мембраны грамотрицательных бактерий. В биотехнологии такие прокариоты активно используются для биосинтеза целевых белков. Очевидно, что такие белки так или иначе будут загрязнены ЛПС и поэтому должны быть подвергнуты эффективной очистке. Однако ЛПС по своей природе очень устойчивы и к химическому, и к термическому воздействию, что, следовательно, значительно осложняет очистку. Кроме того, положительно заряженные белки, такие как гистоны (pI выше 10,5) могут образовывать комплексы с ЛПС, что еще более затрудняет избавление от этих пирогенных примесей. Основная цель данной работы: разработка высокоэффективного хроматографического способа очистки рекомбинантного производного гистона Н1.3 от ЛПС. Нами были изучены катионообменная, обращено-фазовая хроматография и хроматография гидрофобных взаимодействий. Катионообменная хроматография, примененная в качестве предварительной очистки, существенно концентрировала продукт и снизила содержание эндотоксинов до 150-300 ЭЕ/мг, будучи проведена с использованием традиционного хлорида натрия. Однако даже повторные циклы очистки не способствовали дальнейшему снижению уровня эндотоксинов. Хлорид натрия в подвижной фазе был заменен на хлорид кальция, т.к. показано, что катионы бивалентных металлов способствуют агрегации ЛПС. Полученные результаты оказались существенно лучше (8-10 ЭЕ/мг), но, тем не менее, недостаточными, чтобы продукт мог считаться высокоочищенным (содержание ЛПС в АФС ограничивается 0,5 ЭЕ/мг). Результаты, полученные с помощью хроматографии гидрофобных взаимодействий, оказались отрицательными. Были изучены такие сорбенты, как бутил- и гексил-тойоперлы. Наилучшие результаты, которые были на них получены, - 4-80 ЭЕ/мг.
Показано, что ВЭЖХ является отличным способом очистки от ЛПС. Применение ВЭЖХ позволило минимизировать содержание ЛПС в продукте (менее 0,125 ЭЕ/мг). Однако силикагель ВЭЖХ со временем накапливал на себе эндотоксины, что приводило к спонтанному загрязнению продукта. Мы изучили различные способы депирогенизации силикагеля, среди которых химическое (щелочное или кислотное) и термическое воздействие. Продемонстрировано, что промывка сорбента подвижной фазой, содержащей фосфорную кислоту, воду для инъекций и изопропанол, является наиболее эффективным методом депирогенизации.


Список ссылок

1. Hurley J.C. / Clin.Microbiol.Reviews. 1995. V.8 (2). P.268-292.
2. Hou K. C., Zaniewski R. / Biotechnol. Appl. Biochem. 1990. V. 12. P. 315 – 321.
3. Drugs and Pharmaceutical Sciences, V. 167. Endotoxins: Pyrogens, LAL Testing and Depyrogenation, 3rd ed. / Williams K. L., Marcel Dekker / Inc.— IN, USA, 2007. — 440 p.
4. http://www.fda.gov/ICECI/Inspections/InspectionGuides/InspectionTechnicalGuides/ucm072918.htm
5. Gusarov D. A., Lasman V. A., Kosarev S. A., Sokolova I. V., Vorobjeva T. V., Bairamashvili D. I., Formicka-Zeppezauer G. / Russian Journal of Biopharmaceuticals (Biofarmatsevticheskii Zhurnal). 2010. V.2 (1). P.42-48.
6. Brykova N. S., Bragina N. A., Gusarov D. A., Bairamashvili D. I. / Russian Journal of Biopharmaceuticals (Biofarmatsevticheskii Zhurnal). 2010. V.2 (4). P.25-31.
7. Gusarov D.A., Sokolova I.V., Gusarova V.D., Evteeva E.A., Vorobjeva T.V., Kosarev S.A., Shibanova E.D., Bairamashvili D.I. / Pharmaceutical Chemistry Journal (Khim.-Farm.Zh.), in press.
8. Ryabko Yu. S., Lukin O. V., Shepel E. N., Shibanova E. D., Bairamashvili D. I. / Russian Journal of Biopharmaceuticals (Biofarmatsevticheskii Zhurnal). 2009. V.1 (1). P.34-37.
9. King J., Laemmli U.K. / J.Mol.Biol. 1973. V.75 (2). P.315-324.
10. Gusarov D.A. / Russian Journal of Biopharmaceuticals (Biofarmatsevticheskii Zhurnal). 2009. V.1 (3). P.10-17.
11. Li L., Luo R. G. / Biotechnol. Lett. 1997. V. 19 (2).P. 135 – 138.
12. Petsch D., Anspach F. B. / J. Biotechnol. 2000. V. 76. P. 97-119.
13. Karplus T. E., Ulevitch R. J., Wilson C. B. / J. Immunol.Methods. 1987. V. 105. P. 211-220.
14. Lopes J., Inniss W. E. / J. Bacteriol. 1969. V. 100.P. 1128–1130.
15. Horenstein A. L., Crivellin F., Funaro A., Said M., Malavasi F. / J. Immunol. Methods. 2003. V. 275. P. 99–112.
16. Choi H. J., Yang R., Kunioka M. / J. Appl. Polym.Sci. 1995. V. 58. P. 807–811.
17. Sakata M., Todokoro M., Hirayama C. / Am. Biotechnol.Lab. 2002. V. 20. P. 36–41.
18. Bischoff R., Speck D., Lepage P., Delatre L., Leoux K., Brown S. W., Roitsch C. / Biochemistry. 1991. V. 30. P. 3464–3472.
19. Pyo S.-H., Park H.-B., Hong S.-S., Kim J.-H. / Biotechnol. Lett. 2001. V. 23. P. 737–740.
20. Yasaka Y., Tanaka M. / J. Chromatogr. B. 1994. V. 659. P. 139–143.
21. Li Y., Lander R., Manger W., Lee A. / J. Chromatogr. B. 2004. V. 804. P. 353–358.
22. Shimp R. L., jr., Martin L. B., Zhang Y., Henderson B. S., Duggan P., MacDonald N. J., Lebowitz J., Saul A., Narum D. L. / Prot. Exp. Purif. 2006. V. 50. P. 58–67.
23. Merck-USA / Removal of pyrogens and yeast proteins from hepatitis B virus surface antigen, United States Patent. 1989. No. 4,707,542.
24. Shands J. W., Graham J. A., Nath K. / J. Mol. Biol. 1967. V. 25. P. 15–16.
25. Hannekart-Pokorni E., Dekagel D., Depuydt F. / Eur. J. Biochem. 1973. V. 38. P. 6–13.
26. Seydel U., Labischinski H., Kastowsky M. / Immunobiology. 1993. V. 187. P. 191–197.

положительно заряженные белки, депирогенизация, производственная очистка, гистоны